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建立應用雙室體描儀測定豚鼠氣道阻力和氣道反應性的方法，為哮喘的研究提供有效手段。

方法 應用雙室體描儀分別測定乙酰甲膽堿(Mch)激發(fā)后豚鼠氣道阻力的回復時間；于實驗的第1、15天分別測定正常對照組豚鼠氣道阻力和氣道反應性2次，每次間隔2h，驗證測定結果的重復性；觀察OVA致敏豚鼠OVA激發(fā)前后氣道阻力和氣道反應性的變化情況。結果  PC100濃度的Mch霧化后，豚鼠在1h內(nèi)氣道阻力回到基線水平。正常對照組豚鼠在第1、15天分別測量兩次的基礎氣道阻力sRaw為(3.25±0.67) cmH2O·s、(3.33±0.58)cmH2O·s、(3.30±0.56) cmH2O·s、(3.32±0.75) cmH2O·s，氣道反應性(log2PC100)值分別為8.48±0.94、8.64±1.04、8.56±0.67、8.64±0.60，氣道阻力和氣道反應性兩兩比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。致敏豚鼠OVA激發(fā)后氣道阻力和氣道反應性均較激發(fā)前顯著提高，sRaw分別為(7.08±1.82) cmH2O·s和(2.87±0.53) cmH2O·s(P<0.01)，log2PC100值分別為6.64±1.26和8.48±1.17(P<0.01)。結論 成功建立了應用雙室體積描記法測定豚鼠氣道阻力和氣道反應性的實驗方法。

關鍵詞：體描儀；氣道阻力；氣道反應性；豚鼠

豚鼠容易致敏，能產(chǎn)生Ⅰ型和Ⅳ型變態(tài)反應，是最常用的構建哮喘模型的動物之一。但國內(nèi)文獻所構建的豚鼠哮喘模型往往缺少氣道反應性等呼吸生理指標，嚴格來說，只能算是豚鼠變應性氣道炎癥模型。氣道高反應性(AHR)是支氣管哮喘的基本特征之一，要闡明哮喘的發(fā)病機制，必然要研究AHR的機制。本研究在國內(nèi)率先應用雙室體描儀測定豚鼠的氣道阻力和氣道反應性，旨在建立一種簡便的可重復的測定氣道反應性的方法，為哮喘的研究提供有效的手段。

1  材料和方法

1.1  材料
乙酰甲膽堿(Methacholine，Mch)、雞卵白蛋白(OVA)、氫氧化鋁購自Sigma公司；鹽酸苯海拉明(天津藥業(yè)集團)；便攜式超聲波霧化吸入器(粵華儀器廠)；雙室體描儀(美國BUXCO公司)；微量超聲霧化器(美國Aerogen公司)。

1.2  動物及分組

普通級純白Hartly豚鼠26只，體質(zhì)量(400±50) g，雄性，購自廣東省實驗動物中心，隨機分為3組。正常對照組A：8只豚鼠，應用系列濃度Mch霧化豚鼠直至PC100(霧化某一濃度的Mch后，氣道阻力較基礎氣道阻力上升100%或以上，即停止霧化Mch，該濃度即為PC100)，然后觀察氣道阻力回復至基線水平所用時間。正常對照組B：12只豚鼠，在第1、15天各分別兩次測豚鼠的氣道阻力和氣道反應性，每次間隔2 h。哮喘組C：6只豚鼠，致敏后在OVA激發(fā)前和激發(fā)后分別測定氣道阻力和氣道反應性各1次，時間間隔2 h。

1.3  實驗方法

1.3.1  制作哮喘模型  哮喘模型的制作參照文獻[1]并略作改動。哮喘組豚鼠于實驗第l天腹腔內(nèi)注射含5% OVA和10 mg/ml氫氧化鋁的生理鹽水混合液1 ml致敏，實驗第15天置豚鼠于一35 cm×26 cm×31 cm的塑料箱中，便攜式超聲波霧化吸入器霧化吸入1% OVA生理鹽水溶液2 min，以誘發(fā)豚鼠哮喘發(fā)作，霧化速度為1.3 ml/min。霧化誘喘前10 min豚鼠按4 mg/kg腹腔注射鹽酸苯海拉明，以抑制可能發(fā)生的超敏反應。

1.3.2  氣道阻力和氣道反應性的測定方法  雙室體描儀由頭室和體室組成，各置一流量傳感器，分別用于測量鼻部呼吸引起的氣流變化和胸廓運動引起的氣流變化。流量傳感器感受到的流量變化轉變成電信號，經(jīng)放大器放大，轉換成數(shù)字信號后，通過軟件(BioSystem XA software with NAM analyzer)分析，計算出豚鼠氣道阻力(specific airway resistance，sRaw)。豚鼠頸部套上3個大小適中的橡膠項墊，起到固定豚鼠及保持兩室之間相對密閉的作用。置豚鼠于體描儀中，等豚鼠安靜5 min后，動態(tài)測定sRaw。依次用微量超聲霧化器霧化生理鹽水、25、50、100、200、400、800、1600 mg/L Mch 30 s，霧化速度為0.2 ml/min，霧化完30 s后監(jiān)測sRaw 2 min。若sRaw上升較基礎sRaw上升小于100%，即霧化下一濃度。當霧化某一濃度的Mch后，sRaw較基礎sRaw上升100%或以上，確定這一Mch濃度為PC100。此時即停止霧化Mch。某豚鼠的PC100值越大，證明此豚鼠的氣道反應性越低。
1.4  統(tǒng)計學處理
采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行分析，各豚鼠所測得的PC100值進行l(wèi)og2數(shù)值變換。各指標(計量資料)用均數(shù)±標準差表示，顯著性檢驗用單因素方差分析。組間比較用LSD(方差齊時)或Tamhane's T2(方差不齊時)；OVA致敏豚鼠OVA激發(fā)前后氣道阻力和氣道反應性的比較應用配對t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2  結果

2.2  Mch激發(fā)豚鼠后sRaw回復至基礎水平所要時間
應用PC100濃度的Mch霧化豚鼠，豚鼠的sRaw較基礎阻力上升1倍后，部分豚鼠的sRaw仍可繼續(xù)上升，4 min后阻力逐步回落，一般30 min內(nèi)可以回落至基礎值水平，6號豚鼠6 min氣道阻力即回落至基礎水平，但4號豚鼠1 h后氣道阻力才回落至基礎水平。

2.3  雙室體描儀測量豚鼠sRaw和氣道反應性測量結果的重復性
正常對照組B豚鼠在第1、15天分別測量兩次基礎氣道阻力sRaw為(3.25±0.67) cmH2O·s、(3.33±0.58) cmH2O·s、(3.30±0.56) cmH2O·s、(3.32±0.75) cmH2O·s，4個時間點測量的氣道阻力兩兩比較，差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。相對應測量豚鼠的4次的氣道反應性(log2PC100)值分別為8.48±0.94、 8.64±1.04、 8.56±0.67、 8.64±0.60，其值兩兩比較，差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。此說明應用雙室體描儀測量豚鼠sRaw和氣道反應性的重復性良好，可對豚鼠進行這兩項指標的動態(tài)多次檢測。

2.4  驗證豚鼠的哮喘模型
哮喘模型組豚鼠OVA激發(fā)前后sRaw分別為(2.87±0.53) cmH2O·s和(7.08±1.82) cmH2O·s(P<0.01)，說明豚鼠OVA激發(fā)后氣道阻力高于OVA激發(fā)前氣道阻力。OVA激發(fā)前后log2PC100值分別為8.48±1.17和6.64±1.26(P<0.01)，說明豚鼠OVA激發(fā)后氣道反應性高于OVA激發(fā)前。從呼吸生理的角度看，應用雙室體描儀測定sRaw和氣道反應性，能有效地驗證豚鼠的哮喘模型。

3  討論

體積描記法是一種無創(chuàng)的測定氣道阻力和氣道反應性的方法，操作簡單，可進行多次測量，便于進行自身對照研究，目前在國外得到較為廣泛的應用。整體體積描記法由Jacky[2]首先報道。其允許動物自由活動、進食、飲水，操作容易，可測定時間長。但應用整體體積描記法測定sRaw的準確性卻受到一些學者的質(zhì)疑[3][4][5]。雙室體積描記法由Johanson[6]首先報道，1979年Pennock[7]應用于豚鼠氣道阻力的測定。由于國內(nèi)條件有限，應用體積描記法測量動物的肺功能少有報道[8]。
豚鼠容易致敏，能產(chǎn)生Ⅰ型和Ⅳ型變態(tài)反應，特別適合于制作過敏性哮喘動物模型。但國內(nèi)文獻所構建的豚鼠哮喘模型往往缺少呼吸生理的功能指標，嚴格來說，只能算是豚鼠變應性氣道炎癥模型。所以有必要對這種“變應性氣道炎癥”進行肺功能的測定以證實哮喘模型的構建成功。同時這種呼吸生理功能的測定，利于觀察藥物等干預手段的效果，利于對哮喘發(fā)病及診療機制的探討。本實驗室在國內(nèi)首次購進美國BUXCO公司的雙室體描儀對豚鼠的sRaw和氣道反應性進行了測定。雙室體積描記系統(tǒng)包括體積描記箱(Plethysmograph)、超聲霧化器(Ultrasonic Nebulizer)及霧化調(diào)節(jié)系統(tǒng)、前置信號放大器(MAXII preamplifier unit)、信號處理系統(tǒng)(BioSystem XA for Windows software)等幾部分。體積描記箱由頭室(用于測量鼻部氣流的變化)和體室(用于測量胸腔氣流的變化)構成，每一室均連接一個流量傳感器以測定室內(nèi)的呼吸流量變化。其工作原理是根據(jù)鼻腔比胸腔的氣流滯后時間dT來計算氣道阻力sRaw。由于先有胸廓的運動才會產(chǎn)生氣體進出體內(nèi)的過程，鼻部的氣流滯后于胸部的氣流產(chǎn)生時差dT，當sRaw增加時，鼻部氣流與胸部氣流的相位差會增加。根據(jù)公式：sRaw=[(TI+TE)/(2π)×(Patm-47)×1.36×2π×dT/(TI+TE)](公式中Patm代表大氣壓，TI代表吸氣時間，TE代表呼氣時間)，通過軟件(BioSystem XA software with NAM analyzer)分析，可以計算出sRaw，從而了解動物的氣道阻力情況。實驗所得數(shù)據(jù)顯示，PC100濃度的Mch霧化豚鼠后，豚鼠的sRaw在幾分鐘內(nèi)仍可上升，在1 h內(nèi)阻力回到基線水平。要排除測定中應用Mch激發(fā)會對下一次sRaw的測定造成影響，兩次測定sRaw的時間間隔應該在1 h以上，所以為了驗證雙室體描儀測量豚鼠sRaw和氣道反應性測量的重復性，實驗第1、15天重復測定正常對照組豚鼠各1次，同一天的測量時間間隔選取為2 h。結果顯示各次的氣道基礎阻力和氣道反應性無明顯差異，證明應用雙室體積描記法測定豚鼠的氣道基礎阻力和氣道反應性的重復性良好。本實驗結果表明，OVA致敏豚鼠激發(fā)后sRaw和氣道反應性較激發(fā)前均顯著提高，證明OVA致敏及激發(fā)豚鼠是簡單有效的構建哮喘模型的方法，雙室體積描記法的應用為哮喘研究提供了有效的手段。


參考文獻：

[1]周林福, 殷凱生. 小劑量三氧化二砷對哮喘豚鼠氣道嗜酸細胞凋亡和核因子κB表達作用的相關性[J]. 中華結核和呼吸雜志, 2002, 25(7): 439.

[2]Jacky JP. A plethysmograph for long-term measurements of ventilation  in unrestrained animals[J]. J Appl Physiol, 1978, 45(4): 644-7.

[3]Petak F, Habre W, Donati YR , et al. Hyperoxia-induced changes in mouse lung mechanics: forced oscillations vs. barometric plethysmography[J]. J Appl Physiol, 2001, 90(6): 2221-30.

[4]Lundblad LK, Irvin CG, Adler A, et al. A reevaluation of the validity of unrestrained plethysmography in mice[J]. J Appl Physiol, 2002, 93(4): 1198-207.

[5]Mitzner W, Tankersley C. Interpreting Penh in mice[J]. J Appl Physiol, 2003,  94(2): 828-31.

[6]Johanson WG Jr, Pierce AK. A noninvasive technique for measure- ment of airway conductance in small animals[J]. J Appl Physiol, 1971, 30(1): 146-50.

[7]Pennock BE, Cox CP, Rogers RM, et al. A noninvasive technique for measurement of changes in specific airway resistance[J]. J Appl Physiol, 1979, 46(2): 399-466.

[8]宋建勇, 任渝祥, 林輝, 等. 用PKC 抑制劑Rottlerin治療小鼠實驗性哮喘的研究[J]. 第三軍醫(yī)大學學報, 2003, 25(16): 1411-4.