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線粒體病(mitochondrial disorders)是遺傳缺損引起線粒體代謝酶缺陷，致使ATP合成障礙、能量來源不足導(dǎo)致的一組異質(zhì)性病變。線粒體是密切與能量代謝相關(guān)的細(xì)胞器，細(xì)胞的成活(氧化磷酸化)和細(xì)胞死亡(凋亡)均與線粒體功能有關(guān)，特別是呼吸鏈的氧化磷酸化異常與許多人類疾病有關(guān)。

奧地利Oroboros 細(xì)胞能量代謝分析儀

檢測(cè)參數(shù)：pO₂（耗氧率）、RCR（呼吸控制比率）、pH（產(chǎn)酸率）、MMP（線粒體膜電位）、ROS（活性氧）、ATP（三磷酸腺苷）、Ca2+（鈣離子）、NO（一氧化氮）、H2S（硫化氫）、TPP+（四苯基膦）、NADH、質(zhì)體醌、植物氧氣釋放速度。
可進(jìn)行單一參數(shù)監(jiān)測(cè)分析以及多參數(shù)實(shí)時(shí)記錄分析并可對(duì)溫度、攪拌速度等條件進(jìn)行控制。

檢測(cè)樣品：線粒體、原代細(xì)胞、傳代細(xì)胞、組織器官、血液、微生物、植物細(xì)胞等。

應(yīng)用領(lǐng)域：運(yùn)動(dòng)生理學(xué)、線粒體醫(yī)學(xué)、老齡化醫(yī)學(xué)、干細(xì)胞醫(yī)學(xué)、癌癥、肥胖、糖尿病、氧化應(yīng)激、藥理與毒理、心血管類疾病、神經(jīng)退行性病變等。

應(yīng)用案例-小鼠心臟線粒體提取
1、準(zhǔn)備工作

打開離心機(jī)，將離心機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)至低溫4℃并保持溫度。確保所有試劑緩沖液、實(shí)驗(yàn)解剖工具、組織勻漿工具以及離心機(jī)轉(zhuǎn)子等均維持在4℃（或者在足夠的冰上操作）

1.1小鼠處死辦法

用頸脫位法處死實(shí)驗(yàn)用的小鼠

1.2線粒體提取流程

a) 實(shí)驗(yàn)解剖，取出小鼠心臟部位，去除多余的血管結(jié)構(gòu)、結(jié)締組織以及脂肪組織等，將處理好的心臟器官立刻放入BIOPS緩沖液中，整個(gè)過程在4℃環(huán)境（或冰上）進(jìn)行

b) 在4℃條件下，將心臟器官放入有蓋培養(yǎng)皿中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，單獨(dú)提取左心室或者使用整個(gè)心臟；操作者需小心去除血液凝塊等組織。將處理好的心臟放入10ml的玻璃燒杯中，加入1ml 4℃ BIOPS緩沖液（見2.1），取低溫剪刀，將實(shí)驗(yàn)心臟組織剪碎至小塊

c) 將組織碎塊放入10ml手動(dòng)玻璃研磨器中，加入2ml線粒體緩沖液B（見2.3），勻速手動(dòng)研磨6-8次，形成心臟組織勻漿液

d) 將心臟組織勻漿液放入50ml離心管中，再加入3ml線粒體緩沖液B

e) 將上述液體在4℃、800g的條件下離心10min

f) 取出上清液，重新放置于新的50ml離心管中

g) 將該上清液再次在4℃、10000g條件下離心10min

h) 移除上清液，保留線粒體沉淀

i) 用500微升線粒體緩沖液A（見2.2）再次懸浮線粒體沉淀，然后，用線粒體緩沖液A將液體定容至2ml，形成線粒體懸浮液

j) 將線粒體懸浮液在4℃、10000g的條件下離心10min，保留沉淀

k) 用懸浮緩沖液（見2.4）再次懸浮線粒體沉淀，定容至200微升

l) 取5微升線粒體懸浮液直接加入O2k能量代謝測(cè)量儀的倉室中，用于線粒體呼吸能力的測(cè)量

m) 將剩余的線粒體懸浮液進(jìn)行分裝，每20微升放入一個(gè)離心管，零下20℃保存，用于后續(xù)的分析（蛋白濃度定量等）

2、試劑

2.1BIOPS器官組織緩沖液

常見于組織器官等實(shí)驗(yàn)材料的緩沖液，詳細(xì)內(nèi)容可咨詢工作人員

2.2線粒體緩沖液A

試劑	最終濃度
甘露醇	225mM
蔗糖	75mM
EGTA	1mM
BSA	2.5mg/ml

2.3 線粒體緩沖液B

在10ml線粒體緩沖液A中加入5mg subtilisin

2.4 懸浮緩沖液

不帶有BSA的線粒體緩沖液A

3、參考文獻(xiàn)

1.Mela L , Seitz S (1979)Isolation of mitochondria with emphasis on heart mitochondria from small amounts of tissue.Methods Enzymol 55:39-46

2.Fontana-Ayoub M, Fasching M, Gnaiger E (2016) Selected media and chemicals for respirometry with mitochondrial preparations. Mitochondr Physiol Network 03.02(18):1-10.

實(shí)驗(yàn)操作：

01 儀器校準(zhǔn)

開機(jī)預(yù)熱10min后，將2 ml（或0.5ml）呼吸介質(zhì)放入倉室中，使用空氣進(jìn)行單點(diǎn)校準(zhǔn)
02 樣本加入

用移液槍量取線粒體懸濁液體積，若體積為20微升，則先從倉室中移除20微升呼吸介質(zhì)，再將20微升的線粒體懸濁液注入倉室中，確保倉室內(nèi)的總體積不變，將上蓋封閉，開始測(cè)量

03 藥物加入

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求按順序加入相應(yīng)藥物，待一種藥物加入后，軟件曲線進(jìn)入平臺(tái)期，則可加入下一種藥物，直至所有藥物加入完全，并每種藥物均出現(xiàn)平臺(tái)期為最佳。注，其中FCCP等解偶聯(lián)劑，需多次添加，直至找到最大呼吸量為止，其他藥物可根據(jù)常規(guī)濃度添加，若無法出現(xiàn)平臺(tái)期，則可重復(fù)滴加，直至找到平臺(tái)期

04 數(shù)據(jù)計(jì)算

所有藥物平臺(tái)期可在軟件上直接選擇有效曲線波段（排除異常波動(dòng)），軟件可直接計(jì)算耗氧率等數(shù)據(jù)

05 熒光參數(shù)

熒光參數(shù)需做介質(zhì)校準(zhǔn)和藥物校準(zhǔn)，軟件提供完整的Protocol，按軟件流程要求操作即可，其校準(zhǔn)主要與介質(zhì)的種類更換，藥物的批次等有直接關(guān)系，若使用相同介質(zhì)，同批次藥物，則所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行一次校準(zhǔn)即可

06 熒光參數(shù)實(shí)驗(yàn)流程

熒光測(cè)量流程與耗氧測(cè)量流程重復(fù)，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)為同時(shí)進(jìn)行、同時(shí)測(cè)量，無需單獨(dú)操作，結(jié)果與耗氧結(jié)果同時(shí)用軟件分析