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腫瘤藥物和腫瘤耐藥性一直存在 “矛”和“盾”的關(guān)系。2022年9月，圣裘德兒童研究醫(yī)院DR. Green研究團(tuán)隊(duì)在國(guó)際最權(quán)威的學(xué)術(shù)期刊之一Cell上發(fā)表了《Sublethal cytochrome c release generates drug-tolerant persister cells》一文，揭示了亞致死性細(xì)胞色素c釋放產(chǎn)生藥物耐受持久性細(xì)胞的機(jī)制。藥物耐受持久性細(xì)胞會(huì)在腫瘤常規(guī)治療以及靶向治療中逃避細(xì)胞凋亡，是有效癌癥治療的主要非遺傳障礙。

示意圖：細(xì)胞色素c誘導(dǎo)血紅素調(diào)節(jié)抑制劑（HRI）激酶的激活以及整合應(yīng)激反應(yīng)（ISR）的參與，促進(jìn)ATF4的合成，使腫瘤細(xì)胞“逃出生天”，引發(fā)后續(xù)的不良預(yù)后。

持久性細(xì)胞系的制備

持久性細(xì)胞在功能上定義為細(xì)胞死亡誘導(dǎo)處理后仍然存活的細(xì)胞。研究人員發(fā)現(xiàn)使用針對(duì)bcl-2、bcl-xl、bcl-w的抑制劑處理后存活下來(lái)的細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)出持久性表型，包括體內(nèi)定植、轉(zhuǎn)移以及對(duì)GPX4抑制鐵死亡的敏感性增加。

首先，研究人員通過(guò)Incucyte® 實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析系統(tǒng)確認(rèn)了細(xì)胞給藥的最大靶向劑量，然后構(gòu)建了持久性細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)持久性細(xì)胞可以使小鼠具有更高的腫瘤負(fù)荷，轉(zhuǎn)移率檢測(cè)發(fā)現(xiàn)持久性細(xì)胞具有更高的轉(zhuǎn)移能力。

Incucyte® 定量分析加入1.5 mM ABT737和3 mM S63845 (S6) 抑制劑處理后，PC9 WT(野生型)細(xì)胞 、PC9 DKO (BAX和BAK雙敲除)細(xì)胞、PC9 TKO(BAX、BAK和BOK三重敲除)細(xì)胞、40 mM Q-VD-OPh+ PC9 WT細(xì)胞（加入抗凋亡藥物對(duì)照組）的死亡情況確認(rèn)細(xì)胞給藥的最大靶向劑量，400 ng/mL PI作為死細(xì)胞染料；尾靜脈注射熒光素酶標(biāo)記細(xì)胞的活體評(píng)估表明，注射持久性細(xì)胞的小鼠具有更高的腫瘤負(fù)荷。

接下來(lái)，研究人員發(fā)現(xiàn)持久性表型在很大程度上取決于Bcl-2家族效應(yīng)蛋白，使用bcl-2、bcl-xl、bcl-w的抑制劑處理BAX、BAK和BOK（TKO）缺陷的PC9（PS）細(xì)胞，并將其與野生型PT細(xì)胞進(jìn)行比較，TKO PS的肺定殖能力及轉(zhuǎn)移潛力與PT細(xì)胞無(wú)顯著性差異。

熒光素酶或CTV 、CFSE標(biāo)記細(xì)胞分析表明持久性細(xì)胞表型依賴于Bcl-2。

細(xì)胞色素c-HRI-AT4通路驅(qū)動(dòng)藥物耐受持久性表型的產(chǎn)生

為了進(jìn)一步了解持久性表型產(chǎn)生的機(jī)制，研究人員對(duì)抑制劑處理后不同時(shí)間點(diǎn)的PC9 PT和相應(yīng)的PS進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測(cè)序。轉(zhuǎn)錄組學(xué)軌跡分析揭示了持久性細(xì)胞中短暫的ISR（綜合應(yīng)激反應(yīng)）表達(dá)譜，并且確定了抑制劑誘導(dǎo)的ISR，依賴于Bcl-2效應(yīng)蛋白，但不依賴于胱天蛋白酶激活。而且亞致死MOMP（線粒體外膜透化）的參與對(duì)ISR激活至關(guān)重要，細(xì)胞色素c激活血紅素調(diào)節(jié)抑制劑 (HRI)并參與持久性表型。最終研究結(jié)果表明，細(xì)胞色素c-HRI-AT4通路驅(qū)動(dòng)藥物耐受持久性表型的產(chǎn)生。

Incucyte® 分析加入1.5 mM ABT737和3 mM S6 處理細(xì)胞色素酶敲除后重新表達(dá)pCYCS WT（細(xì)胞色素酶野生型） 或者pCYCS K72R（細(xì)胞色素酶突變型）的細(xì)胞死亡情況，表明細(xì)胞色素c參與持久性表型，400 ng/mL PI作為死細(xì)胞染料。

Incucyte® 定量分析1.5 mM ABT737和3 mM S6處理的單獨(dú)轉(zhuǎn)染或組合轉(zhuǎn)染siNT、siBAX、siBAK、siBOK的 PC9細(xì)胞死亡情況，表明單獨(dú)BAX的缺失幾乎完全消除了對(duì)藥物的敏感性，BAX為效應(yīng)蛋白，400 ng/mL PI作為死細(xì)胞染料。

這一新發(fā)現(xiàn)解釋了為什么腫瘤細(xì)胞容易對(duì)治療藥物產(chǎn)生耐藥性，雖然不同的治療藥物作用機(jī)制可能不同，但大多數(shù)藥物最終都會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，當(dāng)細(xì)胞死亡被抑制，這些持久性細(xì)胞會(huì)對(duì)癌癥治療產(chǎn)生耐藥性，本研究結(jié)果為開(kāi)發(fā)通過(guò)抑制癌細(xì)胞獲得持久性特征來(lái)阻止復(fù)發(fā)的藥物奠定了基礎(chǔ)。

在本研究中，研究人員多次通過(guò)Incucyte® S3實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析系統(tǒng)監(jiān)測(cè)與分析細(xì)胞死亡，用于確認(rèn)細(xì)胞給藥的最大靶向劑量、關(guān)鍵蛋白是否參與持久性表型等。

為什么要用Incucyte® 實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析系統(tǒng)？

培養(yǎng)箱內(nèi)可長(zhǎng)達(dá)數(shù)周的連續(xù)觀察，最短幾分鐘間隔拍攝，減少人力，防止過(guò)多操作對(duì)細(xì)胞的傷害；這篇文章部分實(shí)驗(yàn)細(xì)胞在處理8小時(shí)后就會(huì)出現(xiàn)明顯的死亡,每30min自動(dòng)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)時(shí)記錄并定量分析細(xì)胞死亡情況，可以不錯(cuò)過(guò)實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵信息，并保證細(xì)胞處在穩(wěn)定培養(yǎng)環(huán)境中；

6個(gè)板位，分別獨(dú)立設(shè)置檢測(cè)程序，可以兼容各種孔板和培養(yǎng)皿，通量高；

高效簡(jiǎn)便的模塊化軟件設(shè)置和數(shù)據(jù)分析，輸出圖片、視頻、生長(zhǎng)曲線等多指標(biāo)多參數(shù)；

大于100種優(yōu)化過(guò)的活細(xì)胞專用熒光試劑、耗材及詳盡的Protocol。文章數(shù)大于12000篇，是長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞成像產(chǎn)品中最多。