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近期，約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員在Science期刊發(fā)表研究成果^[1]。他們發(fā)現(xiàn)了靶向TP53突變的新抗原，篩選出一種抗體片段（H2-scFv）特異性識(shí)別滅活的腫瘤抑制基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)T細(xì)胞殺傷效應(yīng)，證實(shí)了該抗體片段的有效性，開(kāi)創(chuàng)了靶向療法的新領(lǐng)域。此研究中，Incucyte®被選擇并應(yīng)用于免疫細(xì)胞腫瘤殺傷活性的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)分析。

Incucyte® 實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析系統(tǒng)

Incucyte®有什么優(yōu)勢(shì)呢？

免疫細(xì)胞腫瘤殺傷活性的體外評(píng)價(jià)過(guò)程涉及到免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞兩種細(xì)胞存在，因此不能采用傳統(tǒng)的細(xì)胞增殖活性檢測(cè)手段（如MTT、ATP等方法）直接進(jìn)行檢測(cè)。目前常用的免疫細(xì)胞殺傷研究方法包括 51鉻釋放試驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、 ELISpot、3H 胸腺嘧啶和 ATP 檢測(cè)。這些方法步驟繁瑣，耗費(fèi)時(shí)間和人力，很難實(shí)現(xiàn)對(duì)效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞之間相互作用的研究。Incucyte® 位于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，可以長(zhǎng)時(shí)程自動(dòng)采集相差和熒光圖片，實(shí)時(shí)觀察并全自動(dòng)分析腫瘤細(xì)胞殺傷和免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間的相互作用，配合Cell-By-Cell軟件模塊可以自動(dòng)地完成圖片的定量分析，直接測(cè)定腫瘤細(xì)胞的死亡及活力。

H2-scDb 特異性識(shí)別表達(dá) p53R175H 新抗原的癌細(xì)胞

H2-scDb 識(shí)別表達(dá)不同量 HLA-A*02:01 并具有不同 p53 突變狀態(tài)的癌細(xì)胞系的能力，即使H2-scDb的濃度非常低，對(duì)T細(xì)胞的激活功能也是非常明顯的，T 細(xì)胞反應(yīng)導(dǎo)致靶細(xì)胞的有效殺傷，并且是多功能的，如細(xì)胞毒性顆粒蛋白顆粒酶 B 和穿孔素的釋放以及細(xì)胞因子 IFN-γ、腫瘤壞死因子 α (TNF-α)、白細(xì)胞介素2 (IL-2) 等（圖 2A）。腫瘤細(xì)胞周?chē)?T 細(xì)胞聚集，導(dǎo)致它們?cè)?H2-scDb 存在下裂解，也通過(guò)Incucyte® 實(shí)時(shí)活細(xì)胞成像進(jìn)行可視化(圖 2B)。

圖 2.（A）細(xì)胞毒性顆粒蛋白顆粒酶B和穿孔素的釋放以及細(xì)胞因子IFN-γ、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）等曲線；（B）綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的TYK-nu與T細(xì)胞共培養(yǎng)，E:T比為5:1，有或沒(méi)有H2-scDb在Incucyte®系統(tǒng)中連續(xù)監(jiān)測(cè)，顯示24小時(shí)和96小時(shí)拍攝的相位和綠色熒光圖像。

研究人員基于 CRISPR 的技術(shù)對(duì)攜帶內(nèi)源性 HLA-A*02:01 和 p53R175H 的 KMS26、KLE 和 TYK-nu 癌細(xì)胞系中的 TP53 進(jìn)行了基因破壞。H2-scDb 介導(dǎo)的細(xì)胞毒性通過(guò)破壞這些細(xì)胞中的 TP53 類(lèi)似地減輕，通過(guò)Incucyte® 連續(xù)檢測(cè)超過(guò)120h，呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)的定量化殺傷效果(圖3)。

圖 3. TP53野生型（左）或突變型（右）的綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的TYK-nu細(xì)胞中加入不同濃度的H2-scDb和T細(xì)胞以E:T為2:1的比例進(jìn)行共培養(yǎng)。實(shí)時(shí)活細(xì)胞成像檢測(cè)TYK-nu細(xì)胞的生長(zhǎng)。

文章討論了該抗體片段（H2-scFv），可以特異性識(shí)別滅活的腫瘤抑制基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，而不識(shí)別完整細(xì)胞中的 WT 形式，且對(duì)蛋白質(zhì)的突變形式具有特異性。H2 (H2-scDb) 構(gòu)建的雙特異性抗體可以激活 T 細(xì)胞，誘導(dǎo)多功能 T 細(xì)胞效應(yīng)反應(yīng)，包括細(xì)胞毒活性和多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，更好的詮釋了T細(xì)胞對(duì)腫瘤殺傷的效果。因此，可以將該雙特異性抗體作為新型抗體療法的突破口。

總結(jié)

在觀察免疫殺傷時(shí)，往往需要通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的藥物處理，比如ADCC和ADCP效應(yīng)，細(xì)胞因子釋放，逐漸達(dá)到治療效果。不僅需要觀察細(xì)胞形態(tài)，同時(shí)需要監(jiān)測(cè)細(xì)胞因子的產(chǎn)生速率以及殺傷效率，傳統(tǒng)的檢測(cè)手段很容易錯(cuò)失最佳檢測(cè)時(shí)機(jī)。

Incucyte®可直接安裝在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，對(duì)細(xì)胞自動(dòng)連續(xù)（數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月）拍照獲取活細(xì)胞的明場(chǎng)和熒光圖像，實(shí)時(shí)觀察并全自動(dòng)分析腫瘤細(xì)胞殺傷和免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間的相互作用，即混即讀的 96/384 孔檢測(cè)非常適用于篩選試驗(yàn)，為加速臨床前的藥物篩選和開(kāi)發(fā)提供了令人興奮的機(jī)會(huì)。